Współczesna nauka o żywności zajmuje się badaniem struktury, funkcji i oddziaływań pomiędzy składnikami żywności na poziomie molekularnym. W badaniach tych stosowane są nowoczesne metody, które dostarczają odpowiedzi na pytania dotyczące składu oraz właściwości strukturalnych, biologicznych i funkcjonalnych substancji występujących w żywności.
Dzięki bogatej bazie aparaturowej pracownicy Katedry Biochemii Żywności mogą prowadzić prace badawcze z zakresu szeroko rozumianej nauki o żywności i żywieniu. Metody rozdziału oraz określania struktury i funkcji składników żywności, jakimi dysponuje Katedra to: elektroforeza na żelu, elektroforeza dwuwymiarowa ze spektrometrią MALDI-TOF, izoelektryczne ogniskowanie, wysokosprawna chromatografia cieczowa wraz ze spektroskopią w nadfiolecie oraz skaningowa mikroskopia elektronowa wraz z fraktalną charakterystyką obrazu mikrostruktury badanych obiektów.
Badania te uzupełniane są, dzięki współpracy z zagranicznymi i polskimi ośrodkami naukowymi, analizą biopolimerów metodą spektrometrii masowej. Umożliwia ona pomiar masy cząsteczkowej z dokładnością do 0,02% oraz oznaczenie sekwencji np. peptydów. Stosowana jest też metoda dichroizmu kołowego do badania struktury drugorzędowej białek.
Elektroforeza na żelu
Elektroforeza na żelu jest klasyczną (posiadającą ponad stuletnią tradycję) metodą rozdziału składników materiału biologicznego, wykorzystującą zjawisko przemieszczania się naładowanych cząsteczek pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. W Katedrze Biochemii Żywności używana jest technika elektroforezy na żelu poliakryloamidowym w obecności siarczan dodecylu sodu (SDS-PAGE). Zaletą tej metody jest możliwość analizy białek, które słabo rozpuszczają się w rozpuszczalnikach innych niż roztwory SDS. Oznaczenia jakościowo-ilościowe przeprowadzane tą metodą w Katedrze oparte są na reakcjach barwnych pomiędzy białkiem/polipeptydem a barwnikami, gł. Coomassie Brilliant blue R-250 i G-250. Pomiar ilościowy dokonywany jest za pomocą densytometru.
Przykłady możliwości wykorzystania metody SDS-PAGE obejmują:
- oznaczenia ilościowe oraz oznaczenia masy cząsteczkowej białek/polipeptydów roślinnych i zwierzęcych oraz enzymów z dokładnością 5% (wobec wprowadzonego wzorca lub na podstawie obliczenia ruchliwości elektroforetycznej);
- analizę białek po modyfikacjach; oznaczanie czystości preparatów białkowych i enzymatycznych;
- wykrywanie zafałszowań mleka, mleka w proszku, koncentratów białek mleka, serów innych niż krowie oraz produktów mięsnych przez dodatek mleka;
- oznaczanie miejsc i efektu działania celowo dodanych enzymów wraz z charakterystyką frakcji kazeiny, białek serwatkowych i proteozo-peptonów w produktach mleczarskich;
- badanie procesów asocjacji np. kazeiny-k; oznaczanie w ekstraktach z serów dojrzewających i niedojrzewających efektu pasteryzacji oraz proteolizy białek na skutek różnic wynikających z dodatku różnych kultur bakteryjnych
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
Podstawą rozdziału chromatograficznego są różnice powinowactwa rozdzielanych składników do dwóch nie mieszających się faz, z których jedna jest ruchoma a druga stacjonarna. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest najczęściej stosowaną metodą rozdziału składników materiałów biologicznych. Prawie wszystkie bioaktywne peptydy uzyskane poprzez enzymatyczną hydrolizę białek żywności mogą być wyizolowane przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconej fazie (RP-HPLC).
Katedra Biochemii Żywności dysponuje urządzeniem do HPLC z detektorami UV/VIS, fotodiodowym i fluorescencyjnym do oznaczeń jakościowo-ilościowych (na podstawie wartości absorbancji lub fluorescencji) związków peptydowych, białek, amin biogennych, witamin i cukrów. Ponadto rozdziały chromatograficzne umożliwiają wykrywanie zafałszowań np. preparatów białek sojowych białkami mleka krowiego czy też produktów mięsnych i mleczarskich różnymi rodzajami mleka.
Skutecznym narzędziem do identyfikacji oraz badania zmian np. w peptydach, białkach, cukrach, witaminach są pochodne widm. Aparatura wraz z odpowiednim oprogramowaniem komputerowym jakimi dysponuje Katedra dają możliwość otrzymania widm UV/VIS badanych substancji biologicznie aktywnych. Druga pochodna widma UV może służyć do wykrywania obecności fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu w materiale biologicznym i obliczenia stosunków molowych zawartości tych aminokwasów.
Przykładem zastosowania drugiej pochodnej widma UV jest monitorowanie zmian struktury wtórnej białek kazeinowych czy serwatkowych. Z kolei czwarta pochodna widma UV może być zastosowana do oznaczeń zawartości laktoalbuminy-a, laktoglobuliny-b a także kazeiny w mleku.
Proteomiczne badania białek
W badaniach proteomicznych najczęściej stosuje się techniki wykorzystujące metody chromatograficzne lub elektroforetyczne z metodami komputerowej wizualizacji. W ostatnich latach obserwujemy znaczny rozwój badań łączących techniki elektroforezy dwuwymiarowej ze spektrometrią MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight). Mieszaniny rozpuszczalnych białek są wstępnie rozdzielane metodą elektroforezy dwukierunkowej na podstawie różnicy w wartościach pI (punktu izoelektrycznego) i masy cząsteczkowej. Odpowiednie programy komputerowe do analizy żeli (np.: Image Master) pozwalają na wstępną charakterystykę białek opartą na porównaniu wartości pI oraz masy cząsteczkowej badanych białek i mieszanin standardów białkowych. Plamki odpowiadające pojedynczym białkom na elektroforegramie są w kolejnym etapie wycinane z żelu. Białka są poddawane trawieniu enzymami proteolitycznymi (najczęściej trypsyną) a następnie otrzymane hydrolizaty analizowane przy wykorzystaniu spektrometru masowego MALDI-TOF.
Zastosowanie analizy „peptide mass fingerprinting” pozwala na identyfikację badanych białek Odpowiednie oprogramowanie (typu SONAR PLUS czy ProFound) przetwarza dane dotyczące mas cząsteczkowych otrzymanych fragmentów peptydowych i porównuje z internetowymi bazami danych (np.: NBCI, OWL). Na podstawie stopnia pokrycia sekwencji aminokwasowej program identyfikuje badane białka. Zastosowanie techniki PSD lub PSD w połączeniu z analizą CAF (chemically assisted fragmentation) pozwala dodatkowo na określenie sekwencji aminokwasowej peptydów. W Katedrze Biochemii Żywności znajduje się pracownia proteomiczna wyposażona w zestaw do elektroforezy 2D wraz z oprogramowaniem do dokumentacji i analizy żeli (Image Master 2D Platinum) oraz spektrometr masowy MALDI-TOF Pro wraz z oprogramowaniem Ettan Maldi Pro, ProFound Search, PSD Sonar Search i własną bazą danych Oracle 9i, bezpośrednio współpracującą z centrum NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Baza białek i bioaktywnych peptydów (BIOPEP)
Komputerowe metody analizy sekwencji związków biologicznie aktywnych znajdują coraz szersze zastosowanie w biochemii i biotechnologii. Są one najczęściej stosowane do modelowania struktury wtórnej białek a także do tworzenia baz danych.
Baza BIOPEP zawiera informacje nt. białek będących prekursorami bioaktywnych peptydów (prawie 1000 białek) oraz prawie 2000 biologicznie aktywnych peptydów. Peptydy, o których informacje zgromadzono w bazie danych (44 rodzaje aktywności), wykazują różnorodną aktywność (przeciwnadciśnieniową, immunomodulacyjną, przeciwkrzepliwą, opioidową i in.). Dodatkowo utworzona aplikacja komputerowa – BIOPEP, umożliwia ocenę białek żywności wg następujących wyróżników/kryteriów: częstości występowania fragmentów o danej aktywności w łańcuchu białka, potencjalnej aktywności fragmentów białka oraz profili potencjalnej biologicznej aktywności białka (in. rodzaju i lokalizacji bioaktywnego fragmentu w łańcuchu białkowym).
W oparciu o zaproponowane metody in silico służące do oceny wartości białek, w BIOPEP istnieje również możliwość projektowania procesów proteolizy białek w aspekcie uwalniania biologicznie aktywnych peptydów. Opcja ta może znaleźć zastosowanie przy identyfikacji peptydów metodą spektrometrii masowej. Stosowanie metod komputerowych może być wykorzystane przy projektowaniu żywności specjalnego przeznaczenia w aspekcie uzyskiwania dokładnie zdefiniowanych i pożądanych jej właściwości – tzw. żywności funkcjonalnej.
Sposób wykrywania i oznaczania obcych białek w preparatach białkowych
Przedmiotem oferty jest sposób wykrywania obecności, identyfikacji a także ilościowego oznaczenia w zakresie 1-99% „obcych” białek w preparatach białkowych. Dotychczasowe metody wykrywania i oznaczania białek takie jak metody elektroforetyczne, metody immunologiczne, metody chromatograficzne mają znaczące ograniczenia, co skłoniło autorów do poszukiwania i opracowania nowej strategii wykrywania i oznaczania obcych białek w preparatach białkowych.
Istota oferty polega na tym, że próbki preparatów białek podejrzane o zawartość innych białek poddaje się enzymatycznej hydrolizie za pomocą specyficznego enzymu proteolitycznego, a następnie przeprowadza się ich analizę chromatograficzną przy zastosowaniu metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconej fazie (RP-HPLC).
W wyniku przeprowadzonej analizy chromatograficznej uzyskuje się dla poszczególnych próbek preparatów białkowych obrazy chromatograficzne specyficznych produktów ich enzymatycznej hydrolizy, czyli tzw. profile peptydowe. Na podstawie analizy statystycznej wyników uzyskanych z chromatogramów (powierzchni pików chromatograficznych) wybierane są frakcje peptydowe o określonych czasach retencji, unikalne dla każdego rodzaju preparatu białkowego. Otrzymane profile chromatograficzne czystych preparatów białkowych oraz kilkunastu zmiennych poziomów udziału białek obcych w mieszaninie z preparatem pozwalają na utworzenie macierzy danych. W opracowanym arkuszu uzyskane profile przyjmuje się jako wzorce porównawcze – „matrycę” dla poszczególnych rodzajów wykrywanych preparatów białkowych w celu praktycznego jej wykorzystania w przemysłowej metodzie wykrywania i oznaczania białek obcych w preparatach białkowych.
Główną zaletą przedstawionej strategii jest możliwość stosowania opracowanej procedury do wykrywania bardzo niskich stężeń obcego białka w białkowych preparatach (na poziomie co najmniej 1%) przy jednoczesnej analizie jakościowej preparatów (określenie rodzaju preparatu). Stwarza to możliwość potwierdzenia autentyczności produktów białkowych. Aplikacja przemysłowo-handlowa w/w metody pozwala na wykrywanie „obcych” białek w preparatach i produktach spożywczych, a tym samym np. wykluczenie z produktów żywnościowych, pozyskiwanych z soi, białek mleka, powodujących alergie. Ponadto, opisana strategia łączy kilka nowoczesnych metod analitycznych, wspomaganych dodatkowo programami komputerowymi oraz opracowanym specjalnym arkuszem kalkulacyjnym, który umożliwia w sposób rutynowy określić skład jakościowo-ilościowy badanego preparatu białkowego. Po uzyskaniu wyników z chromatogramu użytkownik powinien wpisać w odpowiedniej kolumnie w opracowanym arkuszu kalkulacyjnym powierzchnię pików. Reszta obliczeń jest wykonywana automatycznie.
Biblioteki widm UV białek i peptydów
Skutecznym narzędziem do identyfikacji oraz badania zmian np. w peptydach, białkach, witaminach bądź barwnikach są pochodne widm w nadfiolecie i świetle widzialnym. Widma UV/Vis substancji rozdzielanych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) rejestrowano przy pomocy detektora fotodiodowego (DAD). Aparatura HPLC-DAD wraz z odpowiednim oprogramowaniem komputerowym jakimi dysponuje Katedra dają możliwość otrzymywania i przetwarzania pochodnych widm UV/VIS badanych substancji. Drugie pochodne widm UV mogą służyć np. do wykrywania obecności fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu w materiale biologicznym i obliczenia stosunków molowych zawartości tych aminokwasów. Oznaczanie stosunków molowych aminokwasów aromatycznych wykorzystano do rozróżniania np. frakcji kazeiny i białek serwatkowych z mleka krowiego, produktów hydrolizy bydlęcej kazeiny-beta przez plazminę bądź alfa/beta- i gamma-gliadyn pszenicy. Dogodnym narzędziem do identyfikacji substancji stała się chemometryczna analiza pochodnych widm UV, polegająca na obliczaniu tzw. wskaźników podobieństwa między pochodnymi widm wzorców, a pochodnymi widm substancji badanych. Najbardziej wiarygodna okazała się identyfikacja analitów na podstawie trzecich pochodnych widm UV. W badaniach wykorzystywano biblioteki widm UV oraz pochodnych widm (od pierwszej do czwartej) głównych białek mleka krowiego (6 białek), fragmentów kazeiny-beta będących produktami hydrolizy tego białka przez plazminę (8 frakcji), a także alfa/beta-gliadyn pszenicy (2 frakcje) i gamma-gliadyn pszenicy (2 frakcje). Wymienione substancje były rozdzielane metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC). W 2007 roku jest planowane udostępnienie bibliotek widm UV i ich pochodnych na stronie internetowej Katedry Biochemii Żywności.